martes, 27 de noviembre de 2012

TEMAS SIGUIENTES DE LA UNIDAD III DE BIOTECNOLOGÍA


3.5 CONSERVACIÓN IN VITRO
3.5.1 ASPECTOS IMPORTANTES EN LA CONSERVACIÓN IN VITRO

La conservación in vitro tiene que considerarse como parte de la estrategia general de conservación de una especie vegetal; es más bien un auxiliar valioso y un suplemento de la conservación de los recursos genéticos. Solo ocasionalmente, el almacenamiento in vitro sería la única estrategia para conservar una especie dada. Para algunos frutales tropicales como el cacao (Theobroma), la estrategia principal de conservación estaría probablemente en los bancos genéticos in vitro que se utilizan las técnicas in vitro para evaluar la variabilidad genética de la especie, y para la colección e intercambio de esta. Los cultivos de raíces y tubérculos, como papa, yuca y batata (Ipomoea), se almacenarían como semillas durante cortos periodos, de modo que, para ellos, los métodos in vitro serian complementarios para la conservación de genotipos específicos y para el traslado internacional de clones.

Bibliografia



3.5.1.1 REGENERACIÓN
La regeneración del plantas enteras basadas en los sistemas de cultivo de células es, a menudo, el paso que limita la aplicación de técnicas de cultivo in vitro a especies vegetales que no se pueden propagar mediante meristemos preformados. A pesar de la capacidad que tienen para iniciar callo diversos tejidos y órganos de muchas especies cultivadas, la regeneración reproducible de plantas enteras sigue siendo problemática. La regeneración adventicia mediante la embriogénesis somática es muy deseable, ya que el proceso ofrece altas tasas de multiplicación y produce propágalos que poseen ejes de raíz y de yema. Los embriones somáticos pueden desarrollarse de células únicas y se pueden recuperar plantas con genotipos más estables.


3.5.1.2 VARIABILIDAD
La evaluación de la viabilidad de los cultivos in vitro se debe realizar sistemáticamente. En condiciones de crecimiento lento, en que el periodo de trasferencia se extiendo durante meses o años, la frecuencia de evaluación de los cultivos aumenta en comparación con la evaluación que haría al material conservado bajo nitrógeno líquido, por ejemplo. Las características más importantes que se evalúan en el almacenamiento de crecimiento lento de cultivos derivados del ápice de yemas son: contaminación, senescencia de la hoja (razón hojas verdes/hojas muertas), numero de brotes verdes (para micro propagación adicional), numero de nudos viables (verdes) en relación con la longitud del tallo (verde), presencia o ausencia de raíces y ocurrencia de callo.

3.5.1.3 ESTABILIDAD GENÉTICA
La estabilidad genética de los cultivos ha sido, durante mucho tiempo, un motivo de inquietud cuando se piensa aplicar las técnicas in vitro para la conservación del germoplasma. El material recuperado de la conservación in vitro debe representar genéticamente al material utilizado. Cualquier sistema de cultivo in vitro será inaceptable si introduce un alto riesgo de inestabilidad genética o de selección entre genotipos o de ambas cosas.
La monitoria de la estabilidad genética de los cultivos in vitro de las especies cultivadas esta adquiriendo gran interés. Se han adelantado criterios morfológicos, bioquímicos y moleculares para la detección de los cambios genéticos. Se deben desarrollar, como complemento de la evaluación de la estabilidad, técnicas electroforéticas para evaluar la variabilidad de las isozimas en muestras pequeñas de tejido obtenidas de cultivos in vitro. Además, se debe probar la monitoria que se ha hecho a esa estabilidad genética mediante técnicas moleculares, para detectar la variación del polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción de ADN

3.5.1.4 ESTRATEGIAS
La conservación de los recursos filogenéticos mediante los métodos del cultivo in vitro se logra haciendo cambios en el ambiente de cultivo para desacelerar o suprimir totalmente el crecimiento de las células y de los tejidos; el objetivo es aumentar al máximo el periodo de trasferencia del cultivo o extenderlo indefinidamente. No obstante, debe realizarse, como se indico anteriormente, una evaluación científica cuidadosa de las ventajas y desventajas de una estrategia in vitro de la conservación de recursos genéticos para cada caso especifico.


3.5.2 MÉTODOS DE CONSERVACIÓN
Los métodos de conservación de germoplasma pueden dividirse en métodos in situ y métodos ex situ.

Los primeros se basan en la conservación de las plantas en sus hábitat naturales e incluyen la conservación en parques nacionales y en reservas ecológicas, lo cual requiere de un considerable espacio físico e implica altos costos, asociados a la necesidad de mano de obra especializada, control permanente de enfermedades y malezas, a la par que las plantas están expuestas a las inclemencias del clima y de los incendios.
Por otra parte, los métodos de conservación  ex situ se basan en el mantenimiento del material biológico en bancos de semillas, bancos de cultivo  in vitro, colecciones de plantas (en campo, viveros o jardines botánicos).
En general, los bancos de semillas constituyen uno de los métodos más convenientes para la conservación de germoplasma ex situ, porque permiten almacenar una gran variabilidad genética en forma económica y práctica. Para la conservación de semillas el International Plant Genetic Resouces Institute (IPGRI) recomienda su desecación hasta un 3-7% de humedad y su almacenamiento a bajas temperaturas (-18ºC). Este protocolo de conservación es, en general, el más recomendado para la mayoría de las especies que se propagan por semillas y cuyas semillas resisten la desecación sin que ello implique pérdida de viabilidad.

A las semillas que presentan estas características se las denominan «semillas ortodoxas», como por ejemplo las semillas de arroz, trigo, avena, tabaco, tomate y lechuga. Sin embargo, en ciertos casos este método de conservación no es aplicable porque la especie se propaga, en la práctica, vegetativamente, (como la mandioca, papa, caña de azúcar, plátanos y bananos), o bien porque sus semillas pierden rápidamente la viabilidad cuando son sometidas a procesos de desecación. A estas semillas se las denominan «semillas recalcitrantes». Las semillas de numerosas especies que viven en zonas tropicales o subtropicales se incluyen en esta categoría, como por ejemplo las de coco, cacao, frutales tropicales perennes y diversas palmeras.

3.5.2.1 FACTORES QUE LIMITAN EL CRECIMIENTO
Hay dos sistemas básicos de conservación del germoplasma in vitro, uno mediante la limitación del crecimiento hasta tasas mínimas, y otro mediante la supresión total del crecimiento y del metabolismo celular.

Limitación del crecimiento

El método consiste en mantener los cultivos (yemas, plántulas derivadas de nudos o directamente de meristemos) en condiciones físicas (factores ambientales) o químicas (composición del medio de cultivo) que permitan extender al máximo el intervalo de trasferencia a los medios frescos, sin que ello afecte la viabilidad de los cultivos.

La tasa de crecimiento de los cultivos in vitro puede controlarse empleando, principalmente, los siguientes factores: temperatura, nutrimentos inorgánicos y orgánicos, reguladores del crecimiento y concentración osmótica del medio.

·         ü  Temperatura: La mayoría de los cultivos in vitro son mantenidos a temperaturas entre 20 °C y 30 °C.
·         ü  Concentración de nutrimentos: La relación entre la concentración de carbohidratos y los componentes nitrogenados del medio nutritivo. La sacarosa tiene un efecto en la viabilidad de los cultivos.
·         ü  Concentración de los reguladores del crecimiento: Los niveles de citoquininas y de inhibidores del crecimiento, como el acido abscísico, interaccionan con la concentración de sacarosa y con la temperatura de conservación y afectan así la viabilidad de los cultivos in vitro.
·         ü  Concentración osmótica: La limitación del crecimiento por causa de la concentración osmótica se debe, posiblemente, a la reducción de la absorción de agua y de nutrientes del medio.



3.5.2.2 SUPRESIÓN DEL CRECIMIENTO
Como se discutió antes, siempre existe un riesgo, mayor o menos, de inestabilidad citogenética cuando se conserva el germoplasma mediante el cultivo de tejidos in vitro a largo plazo. Este riesgo se puede minimizar utilizando tejidos organizados (meristemos, yemas y cultivos derivados) y reduciendo la tasa de crecimiento mediante la temperatura baja. Con forme se reduce la temperatura de un tejido, el metabolismo celular disminuye hasta llegar a un estado de suspensión animada cuando la temperatura alcanza niveles inferiores a -150 °C; a esta temperatura, los procesos biológicos han cesado y las posibles causas de inestabilidad se habrán, por tanto, minimizado o eliminado.


3.5.2.3 CRYOCONSERVACIÓN DEL GERMOPLASMA
La crioconservación de plantas es un proceso consistente en la preparación, mantenimiento y preservación a largo plazo de un material vegetal, en unas condiciones de temperatura ultra bajas de –196 ºC, obtenidas mediante nitrógeno líquido (NL). Este método de conservación de material vegetal presenta una serie de ventajas frente a otros sistemas de preservación de recursos filogenéticos: es un método rápido, sencillo, no altera la estabilidad genética del material y reduce sustancialmente el esfuerzo y los costes que representan el mantenimiento de colecciones de germoplasma vegetal in vivo o in vitro, al eliminar casi por completo la mano de obra y evitar los riesgos fitopatológicos y fisiológicos que habitualmente aparecen en el mantenimiento de los bancos de germoplasma vegetales. Hay que señalar el importante ahorro de espacio que supone mantener una colección de especies hortícolas o leñosas en pocos metros cuadrados en vez de en plantaciones de cientos o miles de metros cuadrados.

El elemento fundamental de la crioconservación es el NL que se almacena y mantiene en tanques especiales herméticos que permiten que se mantenga en estado líquido y se evapore muy lentamente, manteniendo una temperatura de –196 ºC. El NL es incoloro, inodoro y no combustible y está a una temperatura de –196 ºC a presión atmosférica, por lo que el contacto con los tejidos provoca el congelamiento del área. Es de fácil manejo pero, teniendo en cuenta que desplaza el oxígeno del aire, hay que tener cuidado al manipularlo, lo que se debe hacer en lugares bien ventilados.

Existen dos métodos de conge-lación. Podemos hablar de un método de congelación lento, y un método de congelación rápido.

o   El método de congelación lento, también llamado método convencional de precongelamiento [Sakai y cols., 1991, Plant Physiology 137: 465-470], consiste en someter el material a un descenso gradual de temperatura desde –10 ºC hasta –30 ºC ó –40 ºC antes de introducir el material en el NL. Esto puede realizarse bajando la temperatura a saltos térmicos relativamente amplios (5 ºC/5 min), o bien a saltos térmicos muy pequeños (0,5 ºC/5 min), siendo este último sistema mucho más lento y dando lugar a una bajada de temperatura aparentemente continua.
o   En el método de congelación rápido o simple, el material vegetal se congela inicialmente a –40 ºC, para pasarlo posteriormente al NL.

Para evitar los daños celulares se recurre generalmente al uso de crioprotectores. Los crioprotectores son sustancias de diferente composición (DMSO, glicerol o etilenglicol) que van a embeber y cubrir el material a conservar, protegiéndolo, al facilitar el paso de agua a través de la célula. Es decir, van a estimular la deshidratación celular antes de la congelación intracelular. Entran en la célula retrasando el proceso de congelación celular, disminuyendo los efectos osmóticos negativos de los solutos intracelulares. En los procedimientos en que se utilizan crioprotectores, el material se somete frecuentemente a pretratamientos como son la encapsulación-desecación o la vitrificación. El método de encapsulación-desecación fue desarrollado por primera vez por Fabre y cols. [1991, Cryoletters 11: 413-426] para ápices de Solanum plureja y consiste básicamente en envolver el material en una cuenta de alginato y, posteriormente, someterlo a desecación, como por ejemplo, usando gel de sílice, antes de introducirlo en el NL. En el método de vitrificación [Sakai y cols., 1990, Cryobiology 27: 657; Sakai y cols., 1991, Plant Physiology 137: 465-470; Sakai y cols., 1991, Plant Science 74: 243-248] se utilizan combinaciones de agentes protectores, como DMSO, glicerol y etilenglicol, a diferentes concentraciones para proteger el material, ya que las combinaciones de agentes protectores son más eficaces que la utilización de cualquier agente en solitario. Una de las mezclas más utilizadas es: DMSO al 1 %, etilenglicol al 1 %, y glicerol al 30 %, o bien, DMSO al 5 o 10%, glicerol al 5 o 10 % y sacarosa.

Bibliografia
http://www.encuentros.uma.es/encuentros98/crioconservacion.htm










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