3.5 CONSERVACIÓN IN VITRO
3.5.1 ASPECTOS IMPORTANTES
EN LA CONSERVACIÓN IN VITRO
La conservación in vitro
tiene que considerarse como parte de la estrategia general de conservación de
una especie vegetal; es más bien un auxiliar valioso y un suplemento de la
conservación de los recursos genéticos. Solo ocasionalmente, el almacenamiento
in vitro sería la única estrategia para conservar una especie dada. Para
algunos frutales tropicales como el cacao (Theobroma), la estrategia principal
de conservación estaría probablemente en los bancos genéticos in vitro que se
utilizan las técnicas in vitro para evaluar la variabilidad genética de la
especie, y para la colección e intercambio de esta. Los cultivos de raíces y
tubérculos, como papa, yuca y batata (Ipomoea), se almacenarían como semillas
durante cortos periodos, de modo que, para ellos, los métodos in vitro serian
complementarios para la conservación de genotipos específicos y para el
traslado internacional de clones.
Bibliografia
3.5.1.1 REGENERACIÓN
La regeneración del plantas
enteras basadas en los sistemas de cultivo de células es, a menudo, el paso que
limita la aplicación de técnicas de cultivo in vitro a especies vegetales que
no se pueden propagar mediante meristemos preformados. A pesar de la capacidad
que tienen para iniciar callo diversos tejidos y órganos de muchas especies
cultivadas, la regeneración reproducible de plantas enteras sigue siendo
problemática. La regeneración adventicia mediante la embriogénesis somática es
muy deseable, ya que el proceso ofrece altas tasas de multiplicación y produce
propágalos que poseen ejes de raíz y de yema. Los embriones somáticos pueden
desarrollarse de células únicas y se pueden recuperar plantas con genotipos más
estables.
3.5.1.2
VARIABILIDAD
La
evaluación de la viabilidad de los cultivos in vitro se debe realizar
sistemáticamente. En condiciones de crecimiento lento, en que el periodo de
trasferencia se extiendo durante meses o años, la frecuencia de evaluación de
los cultivos aumenta en comparación con la evaluación que haría al material
conservado bajo nitrógeno líquido, por ejemplo. Las características más
importantes que se evalúan en el almacenamiento de crecimiento lento de
cultivos derivados del ápice de yemas son: contaminación, senescencia de la
hoja (razón hojas verdes/hojas muertas), numero de brotes verdes (para micro
propagación adicional), numero de nudos viables (verdes) en relación con la
longitud del tallo (verde), presencia o ausencia de raíces y ocurrencia de
callo.
3.5.1.3 ESTABILIDAD GENÉTICA
La estabilidad genética de
los cultivos ha sido, durante mucho tiempo, un motivo de inquietud cuando se
piensa aplicar las técnicas in vitro para la conservación del germoplasma. El
material recuperado de la conservación in vitro debe representar genéticamente
al material utilizado. Cualquier sistema de cultivo in vitro será inaceptable
si introduce un alto riesgo de inestabilidad genética o de selección entre
genotipos o de ambas cosas.
La monitoria de la
estabilidad genética de los cultivos in vitro de las especies cultivadas esta
adquiriendo gran interés. Se han adelantado criterios morfológicos, bioquímicos
y moleculares para la detección de los cambios genéticos. Se deben desarrollar,
como complemento de la evaluación de la estabilidad, técnicas electroforéticas
para evaluar la variabilidad de las isozimas en muestras pequeñas de tejido
obtenidas de cultivos in vitro. Además, se debe probar la monitoria que se ha
hecho a esa estabilidad genética mediante técnicas moleculares, para detectar
la variación del polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción
de ADN
3.5.1.4 ESTRATEGIAS
La conservación de los
recursos filogenéticos mediante los métodos del cultivo in vitro se logra
haciendo cambios en el ambiente de cultivo para desacelerar o suprimir
totalmente el crecimiento de las células y de los tejidos; el objetivo es
aumentar al máximo el periodo de trasferencia del cultivo o extenderlo
indefinidamente. No obstante, debe realizarse, como se indico anteriormente,
una evaluación científica cuidadosa de las ventajas y desventajas de una
estrategia in vitro de la conservación de recursos genéticos para cada caso
especifico.
3.5.2 MÉTODOS DE
CONSERVACIÓN
Los métodos de conservación
de germoplasma pueden dividirse en métodos in situ y métodos ex situ.
Los primeros se basan en la
conservación de las plantas en sus hábitat naturales e incluyen la conservación
en parques nacionales y en reservas ecológicas, lo cual requiere de un
considerable espacio físico e implica altos costos, asociados a la necesidad de
mano de obra especializada, control permanente de enfermedades y malezas, a la
par que las plantas están expuestas a las inclemencias del clima y de los
incendios.
Por otra parte, los métodos
de conservación ex situ se basan en el mantenimiento del material
biológico en bancos de semillas, bancos de cultivo in vitro, colecciones
de plantas (en campo, viveros o jardines botánicos).
En general, los bancos de
semillas constituyen uno de los métodos más convenientes para la conservación
de germoplasma ex situ, porque permiten almacenar una gran variabilidad
genética en forma económica y práctica. Para la conservación de semillas el
International Plant Genetic Resouces Institute (IPGRI) recomienda su desecación
hasta un 3-7% de humedad y su almacenamiento a bajas temperaturas (-18ºC). Este
protocolo de conservación es, en general, el más recomendado para la mayoría de
las especies que se propagan por semillas y cuyas semillas resisten la
desecación sin que ello implique pérdida de viabilidad.
A las semillas que presentan
estas características se las denominan «semillas ortodoxas», como por ejemplo
las semillas de arroz, trigo, avena, tabaco, tomate y lechuga. Sin embargo, en
ciertos casos este método de conservación no es aplicable porque la especie se
propaga, en la práctica, vegetativamente, (como la mandioca, papa, caña de
azúcar, plátanos y bananos), o bien porque sus semillas pierden rápidamente la
viabilidad cuando son sometidas a procesos de desecación. A estas semillas se
las denominan «semillas recalcitrantes». Las semillas de numerosas especies que
viven en zonas tropicales o subtropicales se incluyen en esta categoría, como
por ejemplo las de coco, cacao, frutales tropicales perennes y diversas
palmeras.
3.5.2.1 FACTORES QUE LIMITAN
EL CRECIMIENTO
Hay dos sistemas básicos de
conservación del germoplasma in vitro, uno mediante la limitación del
crecimiento hasta tasas mínimas, y otro mediante la supresión total del
crecimiento y del metabolismo celular.
Limitación del crecimiento
El método consiste en
mantener los cultivos (yemas, plántulas derivadas de nudos o directamente de
meristemos) en condiciones físicas (factores ambientales) o químicas
(composición del medio de cultivo) que permitan extender al máximo el intervalo
de trasferencia a los medios frescos, sin que ello afecte la viabilidad de los
cultivos.
La tasa de crecimiento de
los cultivos in vitro puede controlarse empleando, principalmente, los
siguientes factores: temperatura, nutrimentos inorgánicos y orgánicos,
reguladores del crecimiento y concentración osmótica del medio.
·
ü Temperatura: La mayoría de los
cultivos in vitro son mantenidos a temperaturas entre 20 °C y 30 °C.
·
ü Concentración de nutrimentos: La
relación entre la concentración de carbohidratos y los componentes nitrogenados
del medio nutritivo. La sacarosa tiene un efecto en la viabilidad de los
cultivos.
·
ü Concentración de los reguladores
del crecimiento: Los niveles de citoquininas y de inhibidores del crecimiento,
como el acido abscísico, interaccionan con la concentración de sacarosa y con
la temperatura de conservación y afectan así la viabilidad de los cultivos in
vitro.
·
ü Concentración osmótica: La
limitación del crecimiento por causa de la concentración osmótica se debe,
posiblemente, a la reducción de la absorción de agua y de nutrientes del medio.
3.5.2.2 SUPRESIÓN DEL
CRECIMIENTO
Como se discutió antes,
siempre existe un riesgo, mayor o menos, de inestabilidad citogenética cuando
se conserva el germoplasma mediante el cultivo de tejidos in vitro a largo
plazo. Este riesgo se puede minimizar utilizando tejidos organizados
(meristemos, yemas y cultivos derivados) y reduciendo la tasa de crecimiento
mediante la temperatura baja. Con forme se reduce la temperatura de un tejido,
el metabolismo celular disminuye hasta llegar a un estado de suspensión animada
cuando la temperatura alcanza niveles inferiores a -150 °C; a esta temperatura,
los procesos biológicos han cesado y las posibles causas de inestabilidad se
habrán, por tanto, minimizado o eliminado.
3.5.2.3 CRYOCONSERVACIÓN DEL
GERMOPLASMA
La crioconservación de
plantas es un proceso consistente en la preparación, mantenimiento y
preservación a largo plazo de un material vegetal, en unas condiciones de
temperatura ultra bajas de –196 ºC, obtenidas mediante nitrógeno líquido (NL).
Este método de conservación de material vegetal presenta una serie de ventajas
frente a otros sistemas de preservación de recursos filogenéticos: es un método
rápido, sencillo, no altera la estabilidad genética del material y reduce
sustancialmente el esfuerzo y los costes que representan el mantenimiento de
colecciones de germoplasma vegetal in vivo o in vitro, al
eliminar casi por completo la mano de obra y evitar los riesgos fitopatológicos
y fisiológicos que habitualmente aparecen en el mantenimiento de los bancos de
germoplasma vegetales. Hay que señalar el importante ahorro de espacio que
supone mantener una colección de especies hortícolas o leñosas en pocos metros
cuadrados en vez de en plantaciones de cientos o miles de metros cuadrados.
El elemento fundamental de
la crioconservación es el NL que se almacena y mantiene en tanques especiales
herméticos que permiten que se mantenga en estado líquido y se evapore muy
lentamente, manteniendo una temperatura de –196 ºC. El NL es incoloro, inodoro
y no combustible y está a una temperatura de –196 ºC a presión atmosférica, por
lo que el contacto con los tejidos provoca el congelamiento del área. Es de
fácil manejo pero, teniendo en cuenta que desplaza el oxígeno del aire, hay que
tener cuidado al manipularlo, lo que se debe hacer en lugares bien ventilados.
Existen dos métodos de
conge-lación. Podemos hablar de un método de congelación lento, y un método
de congelación rápido.
o El método
de congelación lento, también llamado método convencional de precongelamiento
[Sakai y cols., 1991, Plant Physiology 137: 465-470],
consiste en someter el material a un descenso gradual de temperatura desde –10
ºC hasta –30 ºC ó –40 ºC antes de introducir el material en el NL. Esto puede
realizarse bajando la temperatura a saltos térmicos relativamente amplios (5
ºC/5 min), o bien a saltos térmicos muy pequeños (0,5 ºC/5 min), siendo este
último sistema mucho más lento y dando lugar a una bajada de temperatura
aparentemente continua.
o En el
método de congelación rápido o simple, el material vegetal se congela
inicialmente a –40 ºC, para pasarlo posteriormente al NL.
Para evitar los daños
celulares se recurre generalmente al uso de crioprotectores. Los
crioprotectores son sustancias de diferente composición (DMSO, glicerol o
etilenglicol) que van a embeber y cubrir el material a conservar,
protegiéndolo, al facilitar el paso de agua a través de la célula. Es decir,
van a estimular la deshidratación celular antes de la congelación intracelular.
Entran en la célula retrasando el proceso de congelación celular, disminuyendo
los efectos osmóticos negativos de los solutos intracelulares. En los
procedimientos en que se utilizan crioprotectores, el material se somete
frecuentemente a pretratamientos como son la encapsulación-desecación o la
vitrificación. El método de encapsulación-desecación fue desarrollado por
primera vez por Fabre y cols. [1991, Cryoletters 11: 413-426] para ápices
de Solanum plureja y consiste básicamente en envolver el material en
una cuenta de alginato y, posteriormente, someterlo a desecación, como por
ejemplo, usando gel de sílice, antes de introducirlo en el NL. En el método de
vitrificación [Sakai y cols., 1990, Cryobiology 27: 657; Sakai y
cols., 1991, Plant Physiology 137: 465-470; Sakai y cols., 1991, Plant
Science 74: 243-248] se utilizan combinaciones de agentes protectores,
como DMSO, glicerol y etilenglicol, a diferentes concentraciones para proteger
el material, ya que las combinaciones de agentes protectores son más eficaces
que la utilización de cualquier agente en solitario. Una de las mezclas más
utilizadas es: DMSO al 1 %, etilenglicol al 1 %, y glicerol al 30 %, o bien,
DMSO al 5 o 10%, glicerol al 5 o 10 % y sacarosa.
Bibliografia
http://www.encuentros.uma.es/encuentros98/crioconservacion.htm
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