lunes, 19 de noviembre de 2012


UNIDAD III: TECNICAS IN VITRO EN EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
El término cultivo in Vitro (“dentro de vidrio”), hace mayor referencia a la metodología usada que al objetivo de este método. Consiste en el cultivo de plantas, semillas, órganos, explanaos, tejidos, células y protoplastos de plantas superiores dentro de recipientes de vidrio en condiciones de ambiente controlado. Existen dos términos que se relacionan con el significado de cultivo in Vitro:
·       Cultivo de tejidos vegetales (cultivo in Vitro de partes de la planta)
·       Micropropagación (utilización de técnicas d cultivo in Vitro utilizadas a la propagación vegetativa de plantas).
INTRODUCCIÓN HISTÓRICA AL CULTIVO IN VITRO. BASES
·       S. XVIII: Nutrición mineral, cultivos Hidropónicos prolongados. Estudios de fisiología y bioquímica celular.
·       1838: Teoría de la totipotencia celular (Schwann y Schleiden) “toda célula es una entidad viva completa que contiene toda la información del ser vivo al que pertenece y que por lo tanto, cuando se aisla del mismo, es potencialmente capaz de desarrollar un organismo pluricelular completo e idéntico a aquel en que se encuentra” (fundamento de la clonación)
·       Haberlandt 1902. Cultivos “hidropónicos” de células aisladas: células en suspensión de tricomas, epidermis, parénquima en empalizada.
-        Resultado: no mueren pero no se dividen. Fragmentos de tubérculo de patata si se dividen.
-        Causa: presencia de tejidos conductores.
Esta hipótesis no se puede confirmar, lo que lleva a plantear como conclusión lo que de momento es una nueva hipótesis: Falta de “enzimas de crecimiento” (posteriormente se encontrará que estas supuestas enzimas son en realidad las hormonas vegetales: Auxinas (Went, 1926, 1937) y Citoquininas (1957), fundamentalmente).
·       Gautheret (años 30): Primeros cultivos in vitro reales con cambium y tejidos vasculares diferenciados.
·       White, Obecourt y Gautheret (1939): Crecimiento indefinido de tejidos vegetales tumorales (ausencia de citoquininas).
·       Varios autores (años 50 en adelante): Éxito en diferentes órganos y especies (presencia de citoquininas): tejidos tumorales, ápices meristemáticos, embriones manipulados, zanahoria, tomate, tabaco, semillas de orquídeas, callos, cambios en ratios auxinas/citoquininas, diferenciación y organogénesis.
3.1. GENERALIDADES
El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro de tejidos vegetales, es una técnica de reproducción en condiciones totalmente asépticas, en la que a partir de un pequeño segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas genéticamente iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es aplicado un estímulo por medio de variables físicas y químicas controladas en un medio de cultivo.  A diferencia de las técnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta permite la propagación de grandes volúmenes de plantas en menor tiempo; así como el manejo de las mismas en espacios reducidos. Por otro lado, la técnica es de gran utilidad en la obtención de plantas libres de patógenos; plantas homocigotos, en la producción de plantas en peligro de extinción, en estudios de ingeniería genética, etc. El enorme potencial que posee esta metodología ha propiciado que en los últimos 25 años se haya incrementado el número de laboratorios de cultivo de tejidos en el país para la producción comercial de plantas ornamentales y frutales al lo que ha motivado que algunos floricultores la estén utilizando como una alternativa viable en sus programas de producción.  El cultivo in vitro (término que literalmente significa en vidrio), incluye muchas técnicas destinadas a introducir, multiplicar y regenerar, entre otros recursos, material vegetal o animal en condiciones controladas y asépticas. El cultivo in vitro, constituye un paso fundamental en la obtención y regeneración de plantas genéticamente modificadas o transgénicas, mediante técnicas de ingeniería genética.  Es decir que existe una estrecha relación entre el cultivo de tejidos vegetales y la biotecnología moderna. Normalmente se utilizan cultivos de tejidos, seguido de la regeneración de la planta completa, y la subsiguiente expresión de los genes introducidos o transgenes.

3.2_MICROPROPGACION
3.2.1_DESCRIPCION E IMPORTANCIA
Es el conjunto de técnicas y métodos de cultivo de tejidos utilizados para multiplicar plantas asexualmente en forma rápida, eficiente y en grandes cantidades. Se utiliza para multiplicar o propagar plantas nuevas, tales como aquellas creadas por la Ingeniería GenéticaMutagénesis o mejoramiento genético. Se utiliza también la micropropagacion para obtener plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades de plantas que no se propagan eficientemente.
Posiblemente el término “in vitro” ya no resulte extraño. El lenguaje corriente y los medios de comunicación suelen referirse a técnicas defertilización in vitro. Básicamente, se trata de técnicas que se realizan en laboratorios y que permiten la unión de las células sexuales, óvulos y espermatozoides en recipientes de vidrio (de allí “in vitro”).

En el caso de los seres humanos, al formarse el embrión fuera del cuerpo materno en el laboratorio, ya en sus primeras etapas se lo transfiere al útero materno donde sigue su desarrollo hasta el nacimiento. La fecundación in vitro en humanos se logró por primera vez en 1978.

Las plantas le llevan una ventaja a la fecundación in vitro humana. Ya en 1902 se realizaron las primeras experiencias relacionadas al cultivo de tejidos vegetales in vitro. Y en 1922 se logró el primer experimento exitoso: la germinación in vitro de semillas de orquídeas. Luego de la germinación, las plántulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo en condiciones asépticas, y así se mantuvieron protegidas del ataque de microorganismos (hongos, virus y bacterias) hasta convertirse en plantas adultas

3.2.2. TEJIDOS EMPLEADOS

Se podría hablar de tres tipos de cultivos:
1.     Cultivo de órganos. Implica que la arquitectura característica del tejido 'in vivo' se mantiene al menos en parte. Para ello el órgano se mantiene en un medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos y en el que mantiene su estructura tridimensional, en general esférica. Este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares diferenciados y es por ello una buena réplica del tejido de origen, pero por el contrario no permite su propagación pues el crecimiento, de producirse, se limita a la periferia y es debido fundamentalmente a los tipos celulares embrionarios. La imposibilidad de propagar obliga a partir en cada nuevo experimento de nuevo material animal lo que conlleva una elevada hetereogeneidad (Reina, 2003).
2.     Explantes primarios. Fragmentos de tejidos o de órganos que se adhieren a una superficie y en la que proliferan las células de la periferia del explante.
3.     Cultivo celular. Supone una disgregación celular ya sea por medios enzimáticos o mecánicos. La suspensión celular se puede cultivar como una monocapa adherente o en suspensión en el medio de cultivo. Este tipo de cultivo permite su propagación, aumentando notablemente la masa celular del cultivo a lo largo de las generaciones. Como característica negativa se pierde la hetereogeneidad celular de partida, la población se hace uniforme y homogénea al predominar en el cultivo aquellos tipos celulares que tienen superior tasa de crecimiento (Reina, 2003).


Los tejidos a usar para cultivar son:
·       Segmentos nodales
·       Semillas
·       Anteras
·       Meristemos
·       Raíces
·       Segmentos de hojas
·       Segmentos de tallos
·       Segmentos de cambium
·       Embriones
·       Ápices
·       Partes vegetativas (tubérculos, rizomas, bulbos, etc

3.2.3. RUTAS: ORGANOGENESIS Y EMBRIOGENESIS SOMATICA
Organogénesis
La organogénesis consiste en la formación de un primordio unipolar a partir de una yema y el desarrollo de ese primordio en brotes vegetativos que luego enraizan vía la formación y proliferación de meristemas radicales. Los brotes pueden formarse directamente del explante (organogénesis directa) o indirectamente a partir de callos (Jiménez González, 1998). La organogénesis se desarrolla por inoculación de tejido meristemático estéril (yemas axilares o adventicias) en un medio suplementado con niveles óptimos de sales, de compuestos orgánicos y de reguladores de crecimiento. La calidad y cantidad de los componentes del medio dependerá de la especie y del explante que se quiera cultivar in vitro dado que la inducción de un tipo específico de órgano involucra señales aún poco conocidas.  La micropropagacion es la tecnología más difundida de propagación masiva de plantas vía organogénesis. Consiste en un conjunto de procedimientos asépticos de cultivo de órganos, tejidos o células que permitan la producción de poblaciones de plántulas idénticas a la planta original de la que se derivan (Krikorian, 1991). Los cultivos diferenciados son más estables genéticamente que los cultivos indiferenciados. A su vez, los cultivos de yemas axilares que provienen de meristemas preexistentes presentan menores índices de variación genética que el cultivo de yemas adventicias que se originan de novo a partir de tejidos somáticos con desarrollo directo o indirecto a través de la formación de callos (Paniego, 1995; Rice et al., 1992).

Embriogénesis somática
Los embriones que no resultan de la fusión de gametos se definen como embriones somáticos, asexuales o adventicios. Son estructuras bipolares con un eje radical-apical, no poseen conexión vascular con el tejido materno y son capaces de crecer y formar plantas normales (Litz & Jarret, 1991; Jiménez González, 1998). La embriogénesis somática se puede obtener directamente a partir de células aisladas o utilizando callos.  Si bien implícitamente todos las células vegetales tienen la información genética para formar una planta completa y funcional, se usan comúnmente cotiledones e hipocótilos para producir embriones somáticos (Gómez Kosky, 1998b). Generalmente se utilizan medios con altas concentraciones de sales, de sacarosa o de manitol y se necesita la presencia de una auxina para la iniciación del callo embriogénico, habitualmente 2,4-D. Como la maduración y la germinación de los embriones no ocurren en presencia de esta auxina, se debe remover o usarla en bajas concentraciones para permitir el desarrollo. Además, tanto la inducción de la embriogénesis somática como el desarrollo de los estados subsiguientes dependen de la presencia de nitrógeno reducido (Litz & Jarret, 1991). La maduración comienza después que el embrión completa el proceso de histodiferenciación, el crecimiento por mitosis se detiene y la célula comienza a expandirse y a acumular sustancias de reserva. En esta etapa no es necesaria la adición de reguladores de crecimiento en el medio de cultivo, aunque en algunas especies se recomienda el uso de citocininas y en otras la adición de ABA (Gómez Kosky, 1998b).

3.2.4. APLICACION AGRONOMICA
•        Propagación vegetativa. Esto es lo más práctico. Dos técnicas:
-        Micropropagación de estaquillas
-        Organogénesis de callos
•        Producción de plantas libres de virus mediante dos técnicas:
-  Cultivo de meristemos
-  Microinjerto in vitro
•        Permite hacer germinar semillas que son muy difícil de hacer en condiciones normales. Ejemplo: algunas Orquídeas tienen en los campos unos parásitos obligados y en viveros no se pueden reproducir; se inoculan esos parásitos o in vitro.
•        Eliminar la inhibición de germinación de las semillas. El cultivo in vitro es lo más eficaz porque tiene determinados inhibidores y algunos huesos de frutales no son capaces de germinar ya que no tiene desarrollado el embrión.
•        Prevención del aborto embrionario como resultado de incompatibilidad. Se da en cruces de interés científico o intergenéticos, sobre todo en plantas herbáceas. Los cruces incompatibles dan abortos.
•        Aplicación en mejora genética para obtener híbridos, para introducir material genético, etc.
•        Acortar los ciclos de mejora genética. No hay que esperar que pase el periodo juvenil del árbol para ver resultados.
•        Producción de haploides. Cruzamientos o cultivo de polen (anteras). Teniendo ventajas como la obtención rápida de homocigotos y producción de  híbridos.


·       Multiplicación de especies de interés comercial, social o con fines de conservación.
·       Conservación de bancos de germoplasma in vitro
·       Generación de líneas clonales seleccionadas
·       Generación de variantes somaclonales para ampliar base genética en búsqueda de genotipos que presenten ventajas competitivas

Muchas veces dependiendo el fin del cultivo de tejido se puede usar para:
·       Micropropagacion
·       Fitosanidad
·       Mejoramiento
·       Metabolitos secundarios
·       Regeneración de plantas (embriogénesis y organogénesis)

TAREA DEL 3.4.1. PRODUCCIÓN DE HAPLOIDES: CULTIVO DE ANTERAS Y OVULOS
CULTIVO DE ANTERAS:
El cultivo in vitro de anteras es una biotecnología mediante la cual es posible reducir el tiempo necesario para la obtención de líneas homocigóticas estabilizadas; mediante su aplicación sería posible la generación de plantas haploides a partir de microsporas, y posteriormente, por duplicación cromosómica, obtener plantas doble haploides. De esta forma se lograrían líneas puras en un corto tiempo (un año aproximadamente), con lo cual se reducirían costos y se lograrían, con mayor rapidez, nuevos genotipos mejorados. El cultivo in vitro de anteras se utiliza a gran escala para el mejoramiento de algunas especies como el trigo, arroz, cebada, entre otros.


El cultivo de anteras es la manipulación, in vitro de los granos de polen inmaduros (microsporas) contenidos dentro de la antera, para inhibir el desarrollo gametofitico (formación de granos de polen maduros) e inducir el desarrollo esporofitico (formación de plantas). De las plantas producidas por medio de cultivo de anteras, aproximadamente un 40% a 70% puede ser haploide, triploide o tetraploide, mientras que el otro 30%a 60% es diploide y fértil (doble haploide); este es el de mayor interés para el fitomejorador (Nishi y Mitsuoka, 1969).


Una técnica que permite la reducción del genoma es el cultivo in vitro de anteras o la androgénesis in vitro a partir de anteras, que ofrece la posibilidad de obtener resultados en muy corto tiempo. Además, en algunos casos, las plantas resultantes contienen una mezcla de ploidias (Rokka et al., 1996; Farnham, 1998), las cuales pueden ser de gran utilidad en programas de mejoramiento (Hannemman,1994). Algunos resultados son alentadores para el mejoramiento genético de una cantidad considerable de cultivos (Sunderland, 1980; Sonnino et al., 1989). En otros se ha tenido baja eficiencia, debido a que el éxito en la producción de haploides a gran escala depende de numerosos factores físicos, químicos y de la planta. De manera específica, los asociados con el genotipo, el ambiente de cultivo de la planta donadora, la etapa de desarrollo de la microespora, los pretratamientos con bajas temperaturas, los reguladores de crecimiento, y las condiciones de incubación  (Bajaj, 1983; Nitsch, 1983; Keller, 1984; Wenzel y Foroughi-Wehr, 1984; Dodds, 1985; Dunwell, 1991).


CULTIVO DE OVULOS:

El cultivo de óvulos es una técnica que se ha empleado tradicionalmente para evitar barreras de incompatibilidad que dificultan algunos cruces inter e intraespecíficos, para eludir problemas de abscisión prematura del fruto, para la obtención de híbridos que presentan aborto del embrión en estadios tempranos del desarrollo, como vía alternativa a la androgénesis en la obtención de plantas haploides o como sistema experimental para el estudio de la respuesta in vitro de zigotos y proembriones. Los primeros intentos de aislar óvulos fecundados y cultivarlos en condiciones asépticas fueron llevados a cabo por White en 1932 con Antirrhinum majus; sin embargo, la técnica fue desarrollada y perfeccionada en el Departamento de Botánica de la Universidad de Delhi. Ya en 1960 Kanta desarrolló con éxito una técnica de polinización directa del ovario. Para ello, aisló un ovario inmaduro lo cultivó in vitro, lo perforó e introdujo en la cavidad ovarica polen sin germinar. Posteriormente, siguiendo en esta línea, Kanta et al. (1962) intentaron llevar a cabo otras aproximaciones aislando directamente óvulos inmaduros para después polinizarlos in vitro y cultivarlos hasta la obtención de embriones maduros. Esta técnica, denominada test de fertilización o polinización ovular in vitro, se realizó por primera vez en Papaver somniferum y desde entonces ha sido aplicada satisfactoriamente a otras muchas especies. El cultivo de óvulos es un procedimiento complejo aconsejable sólo en los casos en los que sea estrictamente necesario, ya que el porcentaje de éxito es muy bajo y la manipulación del material es difícil. Esto se debe a que el óvulo es una estructura muy pequeña y delicada que requiere microcirugía para su aislamiento, resultando relativamente fácil dañarla. Además, al tratarse de un tejido altamente hidratado, no debe sufrir desecación durante su manipulación, que debe ser rápida y llevarse a cabo bajo una lupa estereoscópica provista de una fuente de luz fría. Es importante recordar que el aislamiento de los óvulos y del polen (en el caso de llevarse a cabo una polinización in vitro) debe hacerse en el estado fisiológico y morfológico correcto ya que de otra forma el proceso no tendría lugar. Por ello, debe hacerse un estudio de la duración de los distintos estadios del desarrollo de los órganos a aislar para saber cuándo se encuentran en el estadio adecuado para su cultivo. El óvulo presenta una gran cantidad de requerimientos nutricionales, algunos no muy claros, que varían con el estadio del desarrollo del mismo y que es necesario poner a punto para cada especie a tratar. Hay que tener en cuenta que el medio no sólo debe ser satisfactorio para el desarrollo del óvulo sino también para otros procesos que como la germinación del polen, son necesarios para la fecundación y desarrollo del embrión. Todo ello complica aún más los requerimientos nutricionales y hace que se busquen, en la medida de lo posible, vías alternativas al cultivo de óvulos aislados. A la hora de llevar a cabo la polinización in vitro, el polen se deposita sobre los óvulos en una gota de medio que permita su germinación o, en los casos en los que el polen sea incapaz de germinar bien sobre el óvulo, se hace germinar primero y luego se añade. Son varios los medios que se emplean para la germinación de los granos de polen, pero todos ellos tienen como componentes fundamentales una elevada concentración de sacarosa y la presencia de ácido bórico. En condiciones normales, el polen germina en pocas horas, y 1-2 días después de la polinización tiene lugar la fecundación de los óvulos. Algunas alternativas al cultivo de óvulos, en algunos casos válidas, son las siguientes :

·       Polinización estigmática in vitro: Esta técnica consiste en el cultivo del pistilo y polinización in vitro del estigma. Este tipo de fertilización no requiere ninguna manipulación especial, salvo si es necesario la emasculación del botón floral, por lo que es una de las más sencillas de llevar a cabo. Se realiza satisfactoriamente en los casos de caída prematura del fruto.
·       Polinización placentaria in vitro: En este método se aislan los óvulos con un trozo de placenta, para lo que se divide el ovario en dos o más mitades de forma que los óvulos queden expuestos. De esta forma, se simplifican tanto el medio nutritivo como las manipulación necesaria para el aislamiento de los óvulos, sufriendo éstos muchos menos daños físicos así como un menor choque hídrico, por lo que el porcentaje de supervivencia se ve incrementado. Esta técnica se puede emplear para evitar barreras de incompatibilidad localizadas en el estigma y/o estilo, así como para la obtención de plantas haploides.

En el caso de plantas que sufren aborto de embriones en estadios tempranos del desarrollo y en aquellos cruces en los que la barrera de incompatibilidad se encuentra a nivel del ovario, es necesario rescatar los óvulos recién fecundados o incluso fecundarlos in vitro. Actualmente, el cultivo de óvulos aislados o con tejido placentario se está empleando cada vez más en la mejora genética de plantas (Hormaza y Herrero, 1996), no sólo porque permite cruces casi imposibles de obtener en la naturaleza, sino porque además permite seleccionar para la fecundación aquellos granos de polen que hayan sido capaces de germinar bajo condiciones de estrés (térmico, salino, etc.), acelerando así la obtención de plantas resistentes (Zamir y Gadish, 1987; Sacher et al., 1983).
RESUMEN DEL LIBRO EN DIGITAL: CULTIVO DE EMBRIONES Y OVULOS
INTRODUCCION:
El cultivo de embriones se ha usado para diferentes propósitos, como los de estudiar los requerimientos nutricionales de embriones en desarrollo, rescatar embriones hibrido que se hayan derivado de cruzamientos interespecificos, producir monoploides y superar la latencia de las semillas. Igualmente el cultivo de óvulos intactos se ha empleado para el rescate de embriones (mediante la polinización y fertilización in vitro) y para inducir embriogénesis somática a partir de nucelas de algunas especies de plantas. El desarrollo de los embriones vegetales se caracteriza por 2 estados distintos: el estado temprano que es heterotrófico y el estado tardío que es autotrófico. Los embriones globulares heterotróficos se desarrollan a expensas del endosperma y poseen una baja capacidad de ciertos nutrimentos como hormonas, aminoácidos, carbohidratos, vitaminas, purinas y pirimidinas que se encuentran en el saco embrionario. Con la formación de los cotiledones, el embrión pasa a ser autótrofo y se pueden aislar de los óvulos y cultivarse in vitro en un medio relativamente simple, que contenga pequeñas cantidades de unos pocos nutrimentos. Diversos estudios con cruzamientos interespecificos demostraron la importancia del normal desarrollo del endosperma en el desarrollo del embrión.  Brink (1947) sugirieron que el aborto de los embriones después de una hibridación amplia se debía probablemente al rompimiento del equilibrio entre el material que constituye ls tejidos ovulares, el embrión en desarrollo y el endosperma. El aborto embrionario puede resultar también de anomalías en el desarrollo, lo que se refleja en un funcionamiento alterado del cigoto, en consecuencia, las anomalías del suspensor afectara la toma de nutrimentos (Blakeslee et al., 1944).


CULTIVO DE EMBRIONES:

Hanning (1940) fue el primero en demostrar que es posible remover de los óvulos de la plantas los embriones de cigotos maduros, y cultivarlos en un medio estéril que contenga los nutrimentos esenciales; en este medio los embriones se pueden desarrollar normalmente y germinar. Laibach (1925; 1929) obtuvo cultivos relativamente exitosos de embriones híbridos maduros procedentes del cruzamientos incompatible de Linum perenne x L. austriacum y de ellos recupero plantas normales. El cultivo de embriones ha sido efectivo en el mejoramiento de la cebada al permitir rescatar los embriones que resultan de la hibridación entre Hordeum vulgare y H. bulbosum; el hibrido es resistente a las bajas temperaturas in vernales a al mildeo. Mediante la aplicación de esta técnica se han logrado algunos cruzamientos intergenéricos. Otra aplicación del cultivo de embriones es el rescate de material de propagación en los frutales cuyas semillas son generalmente de baja viabilidad; también ha servido para obtener híbridos en especies como peras y albaricoques en las cuales se presenta aborto de los embriones. El cultivo de embriones ha ayudado al mejoramiento  genético de especies de arbóreas porque acorta el periodo siembra-floracion; embriones cultivados in vitro no necesitan un periodo de latencia anterior a la germinación. Asimismo ha sido efectivo para acortar el ciclo de mejoramiento de Iris spp., porque acorta el periodo de latencia de las semillas que oscilan entre unos pocos mese y varios años; esta latencia se debe a algunos inhibidores del crecimiento del embrión presente en el endosperma y en la cubierta de la semilla. Por medio del cultivo de embriones es posible acortar la latencia y producir plántulas para el trasplante a las 2 o 3 semanas

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