UNIDAD III: TECNICAS IN VITRO EN
EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
El término cultivo in Vitro
(“dentro de vidrio”), hace mayor referencia a la metodología usada que al
objetivo de este método. Consiste en el cultivo de plantas, semillas, órganos,
explanaos, tejidos, células y protoplastos de plantas superiores dentro de recipientes
de vidrio en condiciones de ambiente controlado. Existen dos términos que
se relacionan con el significado de cultivo in Vitro:
· Cultivo
de tejidos vegetales (cultivo in Vitro de partes de la planta)
· Micropropagación
(utilización de técnicas d cultivo in Vitro utilizadas a la propagación
vegetativa de plantas).
· S.
XVIII: Nutrición mineral, cultivos Hidropónicos prolongados. Estudios de
fisiología y bioquímica celular.
· 1838: Teoría
de la totipotencia celular (Schwann y Schleiden) “toda célula es una entidad
viva completa que contiene toda la información del ser vivo al que pertenece y
que por lo tanto, cuando se aisla del mismo, es potencialmente capaz de
desarrollar un organismo pluricelular completo e idéntico a aquel en que se
encuentra” (fundamento de la clonación)
· Haberlandt
1902. Cultivos “hidropónicos” de células aisladas: células en
suspensión de tricomas, epidermis, parénquima en empalizada.
- Resultado: no
mueren pero no se dividen. Fragmentos de tubérculo de patata si se dividen.
- Causa: presencia
de tejidos conductores.
Esta hipótesis no se puede
confirmar, lo que lleva a plantear como conclusión lo que de momento es una
nueva hipótesis: Falta de “enzimas de crecimiento” (posteriormente se
encontrará que estas supuestas enzimas son en realidad las hormonas vegetales:
Auxinas (Went, 1926, 1937) y Citoquininas (1957), fundamentalmente).
· Gautheret
(años 30): Primeros cultivos in vitro reales con cambium y tejidos
vasculares diferenciados.
· White,
Obecourt y Gautheret (1939): Crecimiento indefinido de tejidos vegetales
tumorales (ausencia de citoquininas).
· Varios
autores (años 50 en adelante): Éxito en diferentes órganos y especies
(presencia de citoquininas): tejidos tumorales, ápices meristemáticos,
embriones manipulados, zanahoria, tomate, tabaco, semillas de orquídeas,
callos, cambios en ratios auxinas/citoquininas, diferenciación y organogénesis.
3.1. GENERALIDADES
El cultivo de tejidos vegetales o
cultivo in vitro de tejidos vegetales, es una técnica de reproducción en
condiciones totalmente asépticas, en la que a partir de un pequeño segmento
inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de
plantas genéticamente iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es
aplicado un estímulo por medio de variables físicas y químicas controladas en
un medio de cultivo. A diferencia de las técnicas tradicionales de cultivo,
esta poderosa herramienta permite la propagación de grandes volúmenes de
plantas en menor tiempo; así como el manejo de las mismas en espacios
reducidos. Por otro lado, la técnica es de gran utilidad en la obtención de
plantas libres de patógenos; plantas homocigotos, en la producción de plantas
en peligro de extinción, en estudios de ingeniería genética, etc. El enorme
potencial que posee esta metodología ha propiciado que en los últimos 25 años
se haya incrementado el número de laboratorios de cultivo de tejidos en el país
para la producción comercial de plantas ornamentales y frutales al lo que ha
motivado que algunos floricultores la estén utilizando como una alternativa
viable en sus programas de producción. El cultivo in vitro (término que
literalmente significa en vidrio), incluye muchas técnicas destinadas a
introducir, multiplicar y regenerar, entre otros recursos, material vegetal o
animal en condiciones controladas y asépticas. El cultivo in vitro, constituye
un paso fundamental en la obtención y regeneración de plantas genéticamente
modificadas o transgénicas, mediante técnicas de ingeniería genética. Es
decir que existe una estrecha relación entre el cultivo de tejidos vegetales y
la biotecnología moderna. Normalmente se utilizan cultivos de tejidos, seguido
de la regeneración de la planta completa, y la subsiguiente expresión de los
genes introducidos o transgenes.
3.2_MICROPROPGACION
3.2.1_DESCRIPCION E IMPORTANCIA
Es el conjunto de técnicas y
métodos de cultivo de tejidos utilizados para multiplicar plantas asexualmente
en forma rápida, eficiente y en grandes cantidades. Se utiliza para multiplicar
o propagar plantas nuevas, tales como aquellas creadas por la Ingeniería Genética, Mutagénesis o mejoramiento
genético. Se utiliza también la micropropagacion para obtener plantas libres de
enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades de plantas que
no se propagan eficientemente.
Posiblemente
el término “in vitro”
ya no resulte extraño. El lenguaje corriente y los medios de comunicación
suelen referirse a técnicas defertilización in
vitro. Básicamente, se trata de técnicas que se realizan en
laboratorios y que permiten la unión de las células sexuales, óvulos y
espermatozoides en recipientes de vidrio (de allí “in vitro”).
En el
caso de los seres humanos, al formarse el embrión fuera del cuerpo materno en
el laboratorio, ya en sus primeras etapas se lo transfiere al útero materno
donde sigue su desarrollo hasta el nacimiento. La fecundación in
vitro en humanos se
logró por primera vez en 1978.
Las
plantas le llevan una ventaja a la fecundación in
vitro humana. Ya en
1902 se realizaron las primeras experiencias relacionadas al cultivo de tejidos vegetales in vitro. Y en
1922 se logró el primer experimento exitoso: la germinación in
vitro de
semillas de orquídeas. Luego de la germinación, las plántulas obtenidas se transfirieron
a un medio de cultivo en condiciones asépticas, y así se mantuvieron protegidas
del ataque de microorganismos (hongos, virus y bacterias) hasta convertirse en
plantas adultas
3.2.2. TEJIDOS EMPLEADOS
Se podría hablar de tres tipos de cultivos:
1. Cultivo
de órganos. Implica que la arquitectura característica del tejido 'in
vivo' se mantiene al menos en parte. Para ello el órgano se mantiene en un
medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos y en
el que mantiene su estructura tridimensional, en general esférica. Este tipo de
cultivo permite mantener los tipos celulares diferenciados y es por ello una buena
réplica del tejido de origen, pero por el contrario no permite su propagación
pues el crecimiento, de producirse, se limita a la periferia y es debido
fundamentalmente a los tipos celulares embrionarios. La imposibilidad de
propagar obliga a partir en cada nuevo experimento de nuevo material animal lo
que conlleva una elevada hetereogeneidad (Reina, 2003).
2. Explantes
primarios. Fragmentos de tejidos o de órganos que se adhieren a una
superficie y en la que proliferan las células de la periferia del explante.
3. Cultivo
celular. Supone una disgregación celular ya sea por medios enzimáticos o
mecánicos. La suspensión celular se puede cultivar como una monocapa adherente
o en suspensión en el medio de cultivo. Este tipo de cultivo permite su propagación,
aumentando notablemente la masa celular del cultivo a lo largo de las
generaciones. Como característica negativa se pierde la hetereogeneidad celular
de partida, la población se hace uniforme y homogénea al predominar en el
cultivo aquellos tipos celulares que tienen superior tasa de crecimiento
(Reina, 2003).
Los tejidos a usar para cultivar
son:
· Segmentos
nodales
· Semillas
· Anteras
· Meristemos
· Raíces
· Segmentos
de hojas
· Segmentos
de tallos
· Segmentos
de cambium
· Embriones
· Ápices
· Partes
vegetativas (tubérculos, rizomas, bulbos, etc
3.2.3. RUTAS: ORGANOGENESIS Y
EMBRIOGENESIS SOMATICA
Organogénesis
La organogénesis consiste en la
formación de un primordio unipolar a partir de una yema y el desarrollo de ese
primordio en brotes vegetativos que luego enraizan vía la formación y
proliferación de meristemas radicales. Los brotes pueden formarse directamente
del explante (organogénesis directa) o indirectamente a partir de callos
(Jiménez González, 1998). La organogénesis se desarrolla por inoculación de
tejido meristemático estéril (yemas axilares o adventicias) en un medio
suplementado con niveles óptimos de sales, de compuestos orgánicos y de
reguladores de crecimiento. La calidad y cantidad de los componentes del medio
dependerá de la especie y del explante que se quiera cultivar in vitro dado que
la inducción de un tipo específico de órgano involucra señales aún poco
conocidas. La micropropagacion es la tecnología más difundida de
propagación masiva de plantas vía organogénesis. Consiste en un conjunto de
procedimientos asépticos de cultivo de órganos, tejidos o células que permitan
la producción de poblaciones de plántulas idénticas a la planta original de la
que se derivan (Krikorian, 1991). Los cultivos diferenciados son más estables
genéticamente que los cultivos indiferenciados. A su vez, los cultivos de yemas
axilares que provienen de meristemas preexistentes presentan menores índices de
variación genética que el cultivo de yemas adventicias que se originan de novo
a partir de tejidos somáticos con desarrollo directo o indirecto a través de la
formación de callos (Paniego, 1995; Rice et al., 1992).
Embriogénesis somática
Los embriones que no resultan de
la fusión de gametos se definen como embriones somáticos, asexuales o
adventicios. Son estructuras bipolares con un eje radical-apical, no poseen
conexión vascular con el tejido materno y son capaces de crecer y formar
plantas normales (Litz & Jarret, 1991; Jiménez González, 1998). La
embriogénesis somática se puede obtener directamente a partir de células
aisladas o utilizando callos. Si bien implícitamente todos las células
vegetales tienen la información genética para formar una planta completa y
funcional, se usan comúnmente cotiledones e hipocótilos para producir embriones
somáticos (Gómez Kosky, 1998b). Generalmente se utilizan medios con altas
concentraciones de sales, de sacarosa o de manitol y se necesita la presencia
de una auxina para la iniciación del callo embriogénico, habitualmente 2,4-D.
Como la maduración y la germinación de los embriones no ocurren en presencia de
esta auxina, se debe remover o usarla en bajas concentraciones para permitir el
desarrollo. Además, tanto la inducción de la embriogénesis somática como el
desarrollo de los estados subsiguientes dependen de la presencia de nitrógeno
reducido (Litz & Jarret, 1991). La maduración comienza después que el embrión
completa el proceso de histodiferenciación, el crecimiento por mitosis se
detiene y la célula comienza a expandirse y a acumular sustancias de reserva.
En esta etapa no es necesaria la adición de reguladores de crecimiento en el
medio de cultivo, aunque en algunas especies se recomienda el uso de
citocininas y en otras la adición de ABA (Gómez Kosky, 1998b).
3.2.4. APLICACION AGRONOMICA
• Propagación
vegetativa. Esto es lo más práctico. Dos técnicas:
- Micropropagación
de estaquillas
- Organogénesis
de callos
• Producción
de plantas libres de virus mediante dos técnicas:
- Cultivo de meristemos
- Microinjerto in vitro
• Permite
hacer germinar semillas que son muy difícil de hacer en condiciones
normales. Ejemplo: algunas Orquídeas tienen en los campos unos parásitos
obligados y en viveros no se pueden reproducir; se inoculan esos parásitos o in
vitro.
• Eliminar
la inhibición de germinación de las semillas. El cultivo in vitro es lo
más eficaz porque tiene determinados inhibidores y algunos huesos de frutales
no son capaces de germinar ya que no tiene desarrollado el embrión.
• Prevención
del aborto embrionario como resultado de incompatibilidad. Se da en cruces
de interés científico o intergenéticos, sobre todo en plantas herbáceas. Los
cruces incompatibles dan abortos.
• Aplicación
en mejora genética para obtener híbridos, para introducir material genético,
etc.
• Acortar
los ciclos de mejora genética. No hay que esperar que pase el periodo juvenil
del árbol para ver resultados.
• Producción
de haploides. Cruzamientos o cultivo de polen (anteras). Teniendo ventajas
como la obtención rápida de homocigotos y producción de híbridos.
·
Multiplicación de especies de interés comercial, social o con fines de
conservación.
· Conservación
de bancos de germoplasma in vitro
· Generación
de líneas clonales seleccionadas
· Generación
de variantes somaclonales para ampliar base genética en búsqueda de genotipos
que presenten ventajas competitivas
Muchas veces dependiendo el fin
del cultivo de tejido se puede usar para:
· Micropropagacion
· Fitosanidad
· Mejoramiento
· Metabolitos
secundarios
· Regeneración
de plantas (embriogénesis y organogénesis)
TAREA DEL 3.4.1. PRODUCCIÓN DE
HAPLOIDES: CULTIVO DE ANTERAS Y OVULOS
CULTIVO DE ANTERAS:
El cultivo in vitro de anteras es
una biotecnología mediante la cual es posible reducir el tiempo necesario para
la obtención de líneas homocigóticas estabilizadas; mediante su aplicación
sería posible la generación de plantas haploides a partir de microsporas, y
posteriormente, por duplicación cromosómica, obtener plantas doble haploides.
De esta forma se lograrían líneas puras en un corto tiempo (un año
aproximadamente), con lo cual se reducirían costos y se lograrían, con mayor
rapidez, nuevos genotipos mejorados. El cultivo in vitro de anteras se utiliza
a gran escala para el mejoramiento de algunas especies como el trigo, arroz,
cebada, entre otros.
El cultivo de anteras es la
manipulación, in vitro de los granos de polen inmaduros (microsporas)
contenidos dentro de la antera, para inhibir el desarrollo gametofitico
(formación de granos de polen maduros) e inducir el desarrollo esporofitico
(formación de plantas). De las plantas producidas por medio de cultivo de
anteras, aproximadamente un 40% a 70% puede ser haploide, triploide o
tetraploide, mientras que el otro 30%a 60% es diploide y fértil (doble haploide);
este es el de mayor interés para el fitomejorador (Nishi y Mitsuoka, 1969).
Una técnica que permite la
reducción del genoma es el cultivo in vitro de anteras o la androgénesis in
vitro a partir de anteras, que ofrece la posibilidad de obtener resultados en
muy corto tiempo. Además, en algunos casos, las plantas resultantes contienen
una mezcla de ploidias (Rokka et al., 1996; Farnham, 1998), las cuales pueden
ser de gran utilidad en programas de mejoramiento (Hannemman,1994). Algunos
resultados son alentadores para el mejoramiento genético de una cantidad
considerable de cultivos (Sunderland, 1980; Sonnino et al., 1989). En otros se
ha tenido baja eficiencia, debido a que el éxito en la producción de haploides
a gran escala depende de numerosos factores físicos, químicos y de la planta.
De manera específica, los asociados con el genotipo, el ambiente de cultivo de
la planta donadora, la etapa de desarrollo de la microespora, los
pretratamientos con bajas temperaturas, los reguladores de crecimiento, y las
condiciones de incubación (Bajaj, 1983; Nitsch, 1983; Keller, 1984;
Wenzel y Foroughi-Wehr, 1984; Dodds, 1985; Dunwell, 1991).
CULTIVO DE OVULOS:
El cultivo de óvulos es una
técnica que se ha empleado tradicionalmente para evitar barreras de
incompatibilidad que dificultan algunos cruces inter e intraespecíficos, para
eludir problemas de abscisión prematura del fruto, para la obtención de
híbridos que presentan aborto del embrión en estadios tempranos del desarrollo,
como vía alternativa a la androgénesis en la obtención de plantas haploides o
como sistema experimental para el estudio de la respuesta in vitro de
zigotos y proembriones. Los primeros intentos de aislar óvulos fecundados y
cultivarlos en condiciones asépticas fueron llevados a cabo por White en 1932
con Antirrhinum majus; sin embargo, la técnica fue desarrollada y perfeccionada
en el Departamento de Botánica de la Universidad de Delhi. Ya en 1960 Kanta
desarrolló con éxito una técnica de polinización directa del ovario. Para ello,
aisló un ovario inmaduro lo cultivó in vitro, lo perforó e introdujo en la
cavidad ovarica polen sin germinar. Posteriormente, siguiendo en esta línea,
Kanta et al. (1962) intentaron llevar a cabo otras aproximaciones
aislando directamente óvulos inmaduros para después polinizarlos in
vitro y cultivarlos hasta la obtención de embriones maduros. Esta técnica,
denominada test de fertilización o polinización ovular in vitro, se
realizó por primera vez en Papaver somniferum y desde entonces ha sido
aplicada satisfactoriamente a otras muchas especies. El cultivo de óvulos es un
procedimiento complejo aconsejable sólo en los casos en los que sea
estrictamente necesario, ya que el porcentaje de éxito es muy bajo y la
manipulación del material es difícil. Esto se debe a que el óvulo es una
estructura muy pequeña y delicada que requiere microcirugía para su
aislamiento, resultando relativamente fácil dañarla. Además, al tratarse de un
tejido altamente hidratado, no debe sufrir desecación durante su manipulación,
que debe ser rápida y llevarse a cabo bajo una lupa estereoscópica provista de
una fuente de luz fría. Es importante recordar que el aislamiento de los óvulos
y del polen (en el caso de llevarse a cabo una polinización in vitro) debe
hacerse en el estado fisiológico y morfológico correcto ya que de otra forma el
proceso no tendría lugar. Por ello, debe hacerse un estudio de la duración de
los distintos estadios del desarrollo de los órganos a aislar para saber cuándo
se encuentran en el estadio adecuado para su cultivo. El óvulo presenta
una gran cantidad de requerimientos nutricionales, algunos no muy claros, que
varían con el estadio del desarrollo del mismo y que es necesario poner a punto
para cada especie a tratar. Hay que tener en cuenta que el medio no sólo debe
ser satisfactorio para el desarrollo del óvulo sino también para otros procesos
que como la germinación del polen, son necesarios para la fecundación y
desarrollo del embrión. Todo ello complica aún más los requerimientos nutricionales
y hace que se busquen, en la medida de lo posible, vías alternativas al cultivo
de óvulos aislados. A la hora de llevar a cabo la polinización in
vitro, el polen se deposita sobre los óvulos en una gota de medio que permita
su germinación o, en los casos en los que el polen sea incapaz de germinar bien
sobre el óvulo, se hace germinar primero y luego se añade. Son varios los
medios que se emplean para la germinación de los granos de polen, pero todos
ellos tienen como componentes fundamentales una elevada concentración de
sacarosa y la presencia de ácido bórico. En condiciones normales, el polen
germina en pocas horas, y 1-2 días después de la polinización tiene lugar la
fecundación de los óvulos. Algunas alternativas al cultivo de óvulos, en
algunos casos válidas, son las siguientes :
· Polinización
estigmática in vitro: Esta técnica consiste en el cultivo del pistilo
y polinización in vitro del estigma. Este tipo de fertilización no requiere
ninguna manipulación especial, salvo si es necesario la emasculación del botón
floral, por lo que es una de las más sencillas de llevar a cabo. Se realiza
satisfactoriamente en los casos de caída prematura del fruto.
· Polinización
placentaria in vitro: En este método se aislan los óvulos con un
trozo de placenta, para lo que se divide el ovario en dos o más mitades de
forma que los óvulos queden expuestos. De esta forma, se simplifican tanto el
medio nutritivo como las manipulación necesaria para el aislamiento de los
óvulos, sufriendo éstos muchos menos daños físicos así como un menor choque
hídrico, por lo que el porcentaje de supervivencia se ve incrementado. Esta
técnica se puede emplear para evitar barreras de incompatibilidad localizadas
en el estigma y/o estilo, así como para la obtención de plantas haploides.
En el caso de plantas que sufren
aborto de embriones en estadios tempranos del desarrollo y en aquellos cruces
en los que la barrera de incompatibilidad se encuentra a nivel del ovario, es
necesario rescatar los óvulos recién fecundados o incluso fecundarlos in
vitro. Actualmente, el cultivo de óvulos aislados o con tejido placentario
se está empleando cada vez más en la mejora genética de plantas (Hormaza y
Herrero, 1996), no sólo porque permite cruces casi imposibles de obtener en la
naturaleza, sino porque además permite seleccionar para la fecundación aquellos
granos de polen que hayan sido capaces de germinar bajo condiciones de estrés
(térmico, salino, etc.), acelerando así la obtención de plantas resistentes
(Zamir y Gadish, 1987; Sacher et al., 1983).
RESUMEN DEL LIBRO EN DIGITAL: CULTIVO
DE EMBRIONES Y OVULOS
INTRODUCCION:
El cultivo de embriones se ha
usado para diferentes propósitos, como los de estudiar los requerimientos
nutricionales de embriones en desarrollo, rescatar embriones hibrido que se
hayan derivado de cruzamientos interespecificos, producir monoploides y superar
la latencia de las semillas. Igualmente el cultivo de óvulos intactos se ha
empleado para el rescate de embriones (mediante la polinización y fertilización
in vitro) y para inducir embriogénesis somática a partir de nucelas de algunas
especies de plantas. El desarrollo de los embriones vegetales se caracteriza
por 2 estados distintos: el estado temprano que es heterotrófico y el estado
tardío que es autotrófico. Los embriones globulares heterotróficos se
desarrollan a expensas del endosperma y poseen una baja capacidad de ciertos
nutrimentos como hormonas, aminoácidos, carbohidratos, vitaminas, purinas y
pirimidinas que se encuentran en el saco embrionario. Con la formación de los
cotiledones, el embrión pasa a ser autótrofo y se pueden aislar de los óvulos y
cultivarse in vitro en un medio relativamente simple, que contenga pequeñas
cantidades de unos pocos nutrimentos. Diversos estudios con cruzamientos
interespecificos demostraron la importancia del normal desarrollo del
endosperma en el desarrollo del embrión. Brink (1947) sugirieron que el
aborto de los embriones después de una hibridación amplia se debía
probablemente al rompimiento del equilibrio entre el material que constituye ls
tejidos ovulares, el embrión en desarrollo y el endosperma. El aborto
embrionario puede resultar también de anomalías en el desarrollo, lo que se
refleja en un funcionamiento alterado del cigoto, en consecuencia, las
anomalías del suspensor afectara la toma de nutrimentos (Blakeslee et al.,
1944).
CULTIVO DE EMBRIONES:
Hanning (1940) fue el primero en
demostrar que es posible remover de los óvulos de la plantas los embriones de
cigotos maduros, y cultivarlos en un medio estéril que contenga los nutrimentos
esenciales; en este medio los embriones se pueden desarrollar normalmente y
germinar. Laibach (1925; 1929) obtuvo cultivos relativamente exitosos de
embriones híbridos maduros procedentes del cruzamientos incompatible
de Linum perenne x L. austriacum y de ellos recupero
plantas normales. El cultivo de embriones ha sido efectivo en el mejoramiento
de la cebada al permitir rescatar los embriones que resultan de la hibridación
entre Hordeum vulgare y H. bulbosum; el hibrido es resistente a
las bajas temperaturas in vernales a al mildeo. Mediante la aplicación de esta
técnica se han logrado algunos cruzamientos intergenéricos. Otra aplicación del
cultivo de embriones es el rescate de material de propagación en los frutales
cuyas semillas son generalmente de baja viabilidad; también ha servido para
obtener híbridos en especies como peras y albaricoques en las cuales se
presenta aborto de los embriones. El cultivo de embriones ha ayudado al
mejoramiento genético de especies de arbóreas porque acorta el periodo
siembra-floracion; embriones cultivados in vitro no necesitan un periodo de
latencia anterior a la germinación. Asimismo ha sido efectivo para acortar el
ciclo de mejoramiento de Iris spp., porque acorta el periodo de latencia de las
semillas que oscilan entre unos pocos mese y varios años; esta latencia se debe
a algunos inhibidores del crecimiento del embrión presente en el endosperma y
en la cubierta de la semilla. Por medio del cultivo de embriones es posible
acortar la latencia y producir plántulas para el trasplante a las 2 o 3 semanas
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